Giới thiệu chung carotenoid
Carotenoids đã được nghiên cứu rộng rãi trong các khác nhau ma trận để phân tích phân phối và mức độ của họ, như chế độ ăn uống giàu carotenoids truyền đạt các đặc tính lợi ích sức khỏe. Chúng là những sắc tố phân bố rộng rãi nhất trong tự nhiên và hơn 700 carotenoids khác nhau đã được xác định cho đến nay. Ở thực vật, chúng hoạt động như các sắc tố phụ trợ cho quá trình quang hợp và tiền thân của hormone thực vật ABA và strigolactones. Mặc dù các hình thức của các carotenoit được tìm thấy trong thực phẩm không nhiều, tuy nhiên, thành phần rất phức tạp và thay đổi cả về chất và lượng. Hơn nữa, ma trận sinh học thường chứa hàng trăm đến hàng ngàn chất chuyển hóa thực vật khác cản trở việc phát hiện carotenoids. Carotenoids được tạo thành từ polyene hydrocarbon chuỗi bao gồm tám đơn vị isopren và được phân loại thành hai nhóm: hydrocarbon (caroten) và dẫn xuất oxy (xanthophylls). Sự hiện diện của liên kết đôi liên hợp và các nhóm tuần hoàn ở đầu dẫn đến sự hình thành của nhiều loại stereoisomers. Trong tự nhiên, carotenoids tồn tại dưới dạng đồng phân cis / trans, tuy nhiên, chúng tồn tại chủ yếu ở dạng đồng phân all-trans ổn định hơn, nhưng đồng phân cis xảy ra. Các carotenoit khác nhau khác nhau đáng kể về cực đại hấp thụ cũng như trong mịn của chúng kết cấu. Phổ hấp thụ của carotenoids là duy nhất, chủ yếu cho thấy ba đỉnh gần nhất. Các tỷ lệ chiều cao đỉnh hấp thụ từ máng giữa đỉnh II và III được sử dụng để phân biệt carotenoids và đồng phân của chúng. Các đồng phân cũng có thể thường là dự kiến được xác định bởi sự hiện diện của một đỉnh cis đỉnh cao. Động vật không thể tổng hợp carotenoids và thu nhận chúng từ thực vật thông qua chế độ ăn uống. Các caroten thành phần của thực vật bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như như giống; bộ phận cây; giai đoạn trưởng thành; khí hậu hoặc địa điểm; thu hoạch và xử lý sau thu hoạch; xử lý và bảo quản. Suốt trong chế biến thực phẩm, mức độ đồng phân cis tăng do sự chuyển đổi của các đồng phân trans. Hậu quả là, định lượng hiệu quả của carotenoids trong cả thực phẩm và mẫu sinh học là cần thiết để hiểu tầm quan trọng của chúng trong chuyển hóa cơ thể và sức khỏe. Một loạt các phương pháp đã được sử dụng để phát hiện các carotenoit trong các mẫu thực phẩm từ sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và HPLC kết hợp với phép đo phổ khối bao gồm MALDI-TOF. Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để xác định và định lượng của carotenoids sử dụng HPLC kết hợp với phát hiện hấp thụ vis UV UV. Mặc dù có thể tách carotene thực hiện sử dụng cả pha thường và pha đảo HPLC, tuy nhiên, HPLC pha thường không phù hợp với tách caroten do tách carotenoit phân cực kém. Ngược lại, HPLC pha đảo cho phép tăng đáng kể sự tương tác giữa phân tích và pha tĩnh không phân cực dẫn đến tăng độ phân giải của carotenoids. Trong số các cột, cột C18 với chế độ đẳng dòng hoặc gradient là thích hợp để tách caroten. Tuy nhiên, C18 cột không phân giải các đồng phân hình học và giải quyết không hiệu quả các đồng phân vị trí, đặc biệt là lutein và zeaxanthin. Để tối đa hóa độ phân giải sắc ký và độ chọn lọc, cột RP-HPLC với triacontyl (C30) phối tử để phân giải carotenoids và các đồng phân của nó. Các cột C30 polymer cũng có khả năng phân giải cis /trans-carotenoit. Tuy nhiên, hiệu quả của C30 cột để phân giải các đồng phân hình học của carotenoids là theo yêu cầu về thời gian chạy dài hơn cần 60 phút trở lên để tách hoàn toàn carotenoids dẫn đến thông lượng thấp. Gần đây, công nghệ UHPLC đã được sử dụng để phân tích carotenoids trong các ma trận khác nhau. UHPLC cung cấp một số lợi thế so với HPLC như công suất đỉnh cao hơn, chiều rộng đỉnh nhỏ hơn, độ nhạy và độ cao cao hơn độ phân giải sắc ký. Thời gian phân tích ngắn hơn cũng tiết kiệm đáng kể dung môi pha động. Kể từ C30 cột pha tĩnh không có sẵn trên thị trường đối với UHPLC, cột C18 đã được sử dụng cho caroten phân tách mặc dù giới hạn là cột C18 kém phân giải đồng phân caroten. Trong một nghiên cứu gần đây, các cột C18 UHPLC được so sánh với cột C30 HPLC. Mặc dù sử dụng C30 Cột HPLC dẫn đến độ phân giải carotenoids tốt hơn, đặc biệt là các đồng phân hình học so với Cột C18 UHPLC, lợi thế này bị phủ nhận bởi thời gian chạy dài hơn cần thiết cho cột HP30 C30 (100 phút so với 23 phút đối với cột C18 UHPLC. Sắc ký dịch siêu tới hạn (SFC) và LC hai chiều toàn diện (LC × LC) cũng đã được áp dụng cho việc tách carotenoids, để tăng cường sự phân tách sắc ký của caroten phức hỗn hợp. Mặc dù cả hai kỹ thuật đều tốt hơn tiềm năng để thực hiện tách carotene phức tạp, Tuy nhiên, đòi hỏi các công cụ chuyên dụng và đắt tiền hơn và thời gian phân tích dài hơn gần gấp đôi so với HPLC. Thời gian phân tích dài hơn cũng đòi hỏi đặc biệt biện pháp phòng ngừa để tránh sự suy giảm caroten. Sự sẵn có của phương pháp HPLC nhanh chóng sử dụng cột C30 cao phân tử sẽ hỗ trợ rất nhiều cho việc tách, nhận dạng và định lượng của các đồng phân caroten khác nhau với độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn.
Phân tích
Người ta biết rằng sự phân tách của carotenoids là ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các tính chất của pha tĩnh. Trong số các pha tĩnh được sử dụng, polyme, các pha tĩnh với các phối tử C30 giúp phân tách tối ưu các carotenoit và các đồng phân của chúng. Ngược lại, các pha tĩnh C18 không đủ độ dày để cho phép sự xâm nhập hoàn toàn của các phân tử carotene dẫn đến sự phân tách đồng phân kém do tương tác pha solutebonded yếu. Đó là nhờ những thuộc tính một cột C30 cung cấp độ phân giải tốt hơn các carotenoit và các đồng phân hình học của chúng hơn C18 cột. Sử dụng cột C30 trong HPLC, tách các caroten, xanthophyl, ubiquinones, tocopherols và plastoquinone trong một lần chạy, tuy nhiên, thời gian phân tích của họ là 42 phút. Trong giai đoạn tối ưu hóa ban đầu, sử dụng dung môi nhị phân chứa (B) methanol/nước (95: 5, v / v) và (C) tert-methyl butyl ether (MTBE), lutein kết hợp với chất diệp lục b kết hợp với độ phân giải sắc ký và nhận dạng chất phân tích. Trong các thử nghiệm liên tiếp bằng cách giới thiệu các bước mới trong gradient, tách tương đối đã tăng đáng kể. Của tất cả gradient được kiểm tra, sự phân tách tốt nhất đã đạt được với (A) methanol / nước (98: 2) và (C) MTBE trong 2 phút ban đầu, điều này giải quyết rõ ràng tất cả các trans-violaxanthin và all-trans-neoxanthin; đỉnh lutein và Chl b, tiếp theo là 10 phút tiếp theo chạy với dung môi (B) metanol / nước (95: 5, v / v) và (C) tert-metyl butyl ether. Việc tách chất diệp lục từ các carotenoit cũng loại bỏ sự cần thiết phải xà phòng hóa các mẫu để loại bỏ diệp lục. Để cải thiện độ phân giải, các dung môi tiêm khác nhau như dichloromethane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, acetone và các tỷ lệ khác nhau của pha động (MeOH và MTBE). Chúng tôi thấy rằng hỗn hợp dung môi pha động (MTBE và MeOH) là lý tưởng nhất để tiêm các chất chuẩn và mẫu trong cột. Phân tích của chúng tôi cho thấy tỷ lệ 2: 3 của MTBE: MeOH là lý tưởng cho các mô màu xanh lá cây trong khi tỷ lệ 3: 1 của MTBE:MeOH là tốt nhất cho trái cà chua chín đỏ. Việc sử dụng hai tỷ lệ khác nhau có liên quan đến sự khác biệt về thành phần của carotenoids trong mô xanh và quả cà chua tương ứng. Vì mô xanh rất giàu xanthophylls, hàm lượng methanol cao trong tiêm dung môi cải thiện độ phân giải của xanthophylls đặc biệt là all-trans-violaxanthin và all-transneoxanthin. Những quả cà chua chín đỏ được làm giàu trong lycopene, do đó cần có hàm lượng MTBE cao hơn để hòa tan hoàn toàn lycopene. Để giải quyết tối ưu carot Sau khi đánh giá cẩn thận các giai đoạn pha động khác nhau / điều kiện, một pha di động gradient bao gồm metanol, nước và methyl-tert butyl ether, như được mô tả trong
Phương pháp
Carotenoids được phân tích bằng HPLC pha đảo, sử dụng Thermo ACCELA U-HPLC (Thermo Fisher Science, Bremen, Đức), detector photodiode (PDA). Carotenoids là được phân tách trên cột C30 ngược pha, 3 μm (250 ×4,6 mm) được ghép nối với cột bảo vệ 20 × 4,6 mm C30 (Công ty YMC, Kyoto, Nhật Bản) sử dụng các pha di động bao gồm của (A) methanol / nước (98: 2, v / v), (B) methanol / nước (95: 5, v / v) và (C) tert-metyl butyl ether. Gradient rửa giải được sử dụng với cột này là 80% A, 20% C tại 0 phút, tiếp theo là độ dốc tuyến tính đến 60% A, 40% C đến 2,00 phút với tốc độ dòng 1,4 ml / phút, ở mức 2,01 phút tốc độ dòng chảy được thay đổi thành 1,00 mL / phút với độ dốc thay đổi thành 60% B, 40% C theo sau là độ dốc tuyến tính đến 0% B, 100% C sau 12 phút và trở về điều kiện ban đầu sau 13:00 phút. Một sự cân bằng lại (7.00 phút) đã được thực hiện ở nồng độ ban đầu là 80% A, 20% C. nhiệt độ cột được duy trì ở 20 ° C. Rửa giải các cực đại được theo dõi ở phạm vi 250 đến 700nm bằng cách sử dụng PDA.