KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG SAPONIN TRONG QUẢ MƯỚP ĐẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG

1. Đặt vấn đề

Cây mướp đắng, một loại cây thực phẩm quen thuộc của Việt Nam, có tên khoa học là Momordica charantia L., thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) [1]. Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây Mướp đắng và chỉ ra rằng thành phần hóa học chính trong quả mướp đắng là các saponin triterpenoid [2-4]. Cao chiết, và một số hợp chất phân lập từ quả mướp đắng có tác dụng giảm nồng độ đường trong máu, bảo vệ và phục hồi tế bào β tiểu đảo tụy (β-cell) dẫn tới tăng bài tiết insulin [5]. Ngoài ra, các nghiên cứu về mướp đắng cho thấy có tác dụng ức chế sự phát triển của ung thư da [6]. Mướp đắng được sử dụng trong y học cổ truyền, trong dân gian làm vị thuốc chữa ho, chữa sốt, và tắm cho trẻ nhỏ nhiều rôm sẩy [1]. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc xác định hàm lượng saponin toàn phần trong mướp đắng theo thời kỳ sinh trưởng. Mặt khác, mướp đắng được trồng trọt có nhiều giống khác nhau, vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong quả mướp đắng. Kết quả của nghiên cứu sẽ là cơ sở góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng dược liệu mướp đắng sử dụng làm thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

2. Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1. Nguyên liệu

Quả mướp đắng được thu hái tại xã Tuy Lộc, huyện Cẩm Khê, tỉnh Phú Thọ, và loài được giám định có tên khoa học là Momordica charantia L., thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), gồm 2 giống dựa trên hình thái quả: quả xanh – nhiều gai (XG); quả xanh lợt – trơn (XT). Mẫu thu hái xong được thái lát, bỏ lõi, sấy ở 60 ^oC đến khô, và được bảo quản tại Bộ môn Dược liệu – Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ.

Hình 1. A. Quả mướp đắng xanh – nhiều gai (XG); B. Quả mướp đắng xanh lợt – trơn (XT)

2.1.2. Hóa chất, dung môi

– Chất chuẩn momordicosid-G được mua của hãng ALB Technology (hàm lượng ≥ 95%).

– Hóa chất: acid sulfuric (H₂SO₄) 72%; dung dich vanilin 8%.

– Dung môi: Ethanol (EtOH) 80%.

2.1.3. Thiết bị

Máy UV-Vis UV 1800, dải đo 190 – 900 nm, (Shimadzu, Nhật Bản); bể chiết siêu âm D-78224 (Elma, Đức); cân phân tích AUW220D (Shimadzu, Nhật Bản); nồi cách thủy WNB14 (Memmert, Đức).

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Xây dựng quy trình định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp đo quang

Điều kiện đo quang

Lấy 1 ml dung dịch mẫu cho phản ứng tạo màu giữa saponin với 0,3 ml vanilin 8% trong 3 ml H₂SO₄ 72%, đun nóng trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 60 ^oC trong 15 phút, sau đó làm lạnh bằng nước đá trong 10 phút. Đo quang ở bước sóng 560 nm bằng máy đo quang UV-Vis [7]. Song song thực hiện mẫu momordicosid-G chuẩn với các dung dịch có nồng độ chính xác là 35, 75, 150, 300, 600, và 800 µg/ml. Dung dịch mẫu trắng cũng được tiến hành song song nhưng không chứa chất phân tích.

Chuẩn bị dung dịch đo quang

Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 3 g mẫu quả mướp đắng đã sấy khô, nghiền nhỏ, và xác định độ ẩm, chiết siêu âm với 100 ml EtOH 80% trong 60 phút, bổ sung EtOH 80% đã bay hơi cho đủ 100 ml. Lọc lấy dịch lọc, sau đó tiến hành cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết. Hòa tan cao chiết bằng 25 ml nước cất chuyển vào bình chiết, chiết xuất với n-butanol (25 ml x 4), tiếp theo loại bỏ dung môi n-butanol thu được cao chiết, hòa tan cao chiết bằng EtOH 80% và chuyển vào bình định mức 100 ml cho tới vạch. Dịch chiết này được tiến hành phản ứng tạo màu như điều kiện đo quang ở trên cho xác định hàm lượng saponin toàn phần.

Dung dịch mẫu chuẩn: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn momordicosid-G trong EtOH 80% để được dung dịch có chứa chính xác các nồng độ 35, 75, 150, 300, 600, và 800 µg/ml.

Thẩm định quy trình định lượng

Quy trình sẽ được thẩm định về tính đặc hiệu, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, hiệu suất thu hồi [8].

Tính toán kết quả

Hàm lượng saponin toàn phần trong các mẫu quả mướp đắng được xác định bằng quy trình đã xây dựng. Thực hiện xác định hàm lượng của mỗi mẫu 3 lần, kết quả là  của các giá trị thực nghiệm thu được.

2.2.2. Áp dụng phương pháp xây dựng được định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu quả Mướp đắng

Quả mướp đắng được thu hái theo thời kỳ phát triển (Bảng 4). Mẫu quả non thu hái lần thứ nhất là sau 7 ngày khi mướp đắng bắt đầu ra hoa, các mẫu tiếp theo thu hái cách nhau 2 ngày. Tất cả các mẫu của mỗi giống (XG, XT) được thu hái trên cùng một cây tại xã Tuy Lộc, huyện Cẩm Khê, tỉnh Phú Thọ.

3. Kết quả nghiên cứu và bàn luận

3.1. Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp đo quang

3.1.1. Tính đặc hiệu của phương pháp

Với điều kiện đo quang và phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn, tiến hành thực hiện đo quang mẫu trắng và mẫu chuẩn momordicosid-G có hàm lượng 5 µg/ml thực hiện như mục 2.2.1, làm lặp lại 6 lần, kết quả đo mẫu trắng không cho tín hiệu, mẫu chuẩn cho tín hiệu.

3.1.2. Độ lặp lại

Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu mướp đắng (được chuẩn bị như trình bày phần phương pháp nghiên cứu). Kết quả được ghi ở Bảng 1 cho thấy có thể áp dụng điều kiện đã lựa chọn để định lượng saponin toàn phần trong mẫu quả Mướp đắng.

Bảng 1. Kết quả độ lặp lại của phương pháp đo quang

3.1.3. Khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng

Pha một dãy gồm 6 dung dịch mẫu momordicosid-G có nồng độ chính xác từ 35 µg/ml đến 800 µg/ml rồi tiến hành đo quang tại bước sóng 560 nm như mô tả trong phần phương pháp. Kết quả được trình bày trong Bảng 2 và đường chuẩn lập được thể hiện ở Hình 2.

Bảng 2. Kết quả xây dựng đường chuẩn

    Hình 2. Đường chuẩn xác định hàm lượng saponin toàn phần

Kết quả khảo sát trên cho thấy với khoảng nồng độ của momordicosid-G từ 35 µg/ml đến 800 µg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt giữa nồng độ và độ hấp thụ quang (hệ số tương quan R² = 0,9995).

3.1.4. Độ đúng của phương pháp

Bổ sung 1 ml dung dịch mẫu chuẩn momordicosid-G ở các nồng độ chính xác 50, 75, và 100 µg/ml vào mẫu mướp đắng đã biết hàm lượng saponin toàn phần. Tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại 5 lần, kết quả được ghi ở Bảng 3.

Bảng 3. Kết quả xác định độ đúng của phương pháp

Từ các dữ liệu thực nghiệm trên thấy rằng phương pháp thực hiện có độ thu hồi cao, đảm bảo độ chính của kết quả định lượng saponin toàn phần trong trong quả mướp đắng.

3.2. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong quả mướp đắng thu hái theo thời gian sinh trưởng

Áp dụng quy trình xây dựng được để định lượng hàm lượng saponin trong quả mướp đắng theo thời gian sinh trưởng thu hái tại xã Tuy Lộc, huyện Cẩm Khê, tỉnh Phú Thọ. Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo momordicosid-G trong mẫu dược liệu khô tuyệt đối và được trình bày trong Bảng 4.

                Bảng 4. Kết quả xác định saponin toàn phần trong quả Mướp đắng

**: P<0,01 khi so sánh XG với XT trong cùng thời điểm thu hái.

Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng saponin toàn phần thay đổi từ lúc quả non tới quả già dao động trong khoảng 6,71 – 31,73 mg/g đối với quả xanh lợt – trơn và 8,87 – 36,86 mg/g đối với quả xanh – nhiều gai.

Số liệu nghiên cứu ở Bảng 4 chỉ ra rằng hàm lượng saponin toàn phần ở cả 2 giống mướp đắng (XG, XT) trồng trọt tại huyện Cẩm Khê, tỉnh Phú Thọ có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của quả, đạt hàm lượng cao nhất vào ngày thứ 21 tính từ lúc ra hoa và ngày 19- 21 thường được người dân thu hái làm thương phẩm. Bên cạnh đó, so sánh hàm lượng saponin toàn phần giữa 2 giống XG và XT ở cùng thời điểm thu hái cho thấy hàm lượng saponin của XG đều cao hơn so với XT có ý nghĩa thống kê (p<0,01).

Mướp đắng là một loài cây nhận được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới. Một số saponin trong mướp đắng có tác dụng sinh học tốt như: 25-oxo-27-normomordicosid-L, momordicosid-K là những chất có tiềm năng tác dụng chống lại sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư HL60 [6]. Hai saponin là charantagenin D và E được chứng minh rằng có nhóm methoxy (OCH₃) ở chuỗi nhánh trong của cấu trúc cucurbitan dẫn tới tác dụng ức chế mạnh tế bào ung thư phổi A549, dòng tế bào u nguyên bào U87, tế bào ung thư biểu mô gan Hep3B [ 9]. Momordicosid-g là một hợp chất sinh học trong cây mướp đắng, có tác dụng chữa lành vết thương phổi và ngăn chặn gây viêm phổi [10]. Một nghiên cứu tìm hiểu tổng quan về tác dụng của mướp đắng trong điều trị bệnh đái tháo đường, Michael và Gudrun đã liệt kê được rất nhiều bằng chứng khoa học về tác dụng tuyệt vời của mướp đắng trong điều trị bệnh đái tháo đường, từ nghiên cứu trên mô hình tế bào, động vật và người bệnh đái tháo đường, tất cả đều khẳng định được tiềm năng của mướp đắng có tác dụng hấp thu glucose và kích thích bài tiết insulin [11].

Với nhiều tác dụng hữu ích như vậy, hiện nay việc sử dụng mướp đắng để sản xuất thành các sản phẩm thực phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe bán trên thị trường với rất nhiều dạng bào chế, tên thương mại khác nhau. Công trình này là cơ sở lựa chọn giống mướp đắng, thời gian thu hái để có hàm lượng hoạt chất tối ưu; góp phần nâng cao và chuẩn hóa chất lượng nguyên liệu ban đầu mướp đắng sử dụng để sản xuất các sản phẩm thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo hướng dẫn GMP (Good Manufacturing Practices).

4. Kết luận

Trong công trình này, chúng tôi đã xây dựng được quy trình định lượng lượng saponin toàn phần trong quả mướp đắng bằng phương pháp đo quang và áp dụng để định lượng saponin toàn phần trong quả mướp đắng theo thời kỳ sinh trưởng từ quả non tới quả già. Kết cho thấy hàm lượng saponin toàn phần trong quả Mướp đắng xanh – nhiều gai lớn hơn trong quả xanh lợt – trơn. Theo thời gian hàm lượng saponin tăng từ lúc ra quả non cho tới lúc quả già. Kết quả của nghiên cứu này gợi ý cho việc thu hái quả mướp đắng cho mục đích sử dụng làm thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khỏe hoặc các sản phẩm khác từ mướp đắng.

Lời cảm ơn: Nhóm tác giả chân thành cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Phú Thọ đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này với mã số 03/ĐT-KHCN.PT/2019.

Tài liệu tham khảo

1. 1. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, 734-735. 2. Chang C.I et al. (2006), “Cucurbitane-Type Triterpenoids from Momordica charantia”. Nat. Prod., 69, 1168-1171. 3. Okabe K. et al. (1982), “Studies on the Constituents of Momodica charantia L. Characterization of the New Cucurbitacin Glycosides of the Immature Fruits. Structure of the Bitter Glycosides, Momordicosides K and L”, Chem. Pharm. Bull., 30, 4334-4340. 4. Kimura Y et al. (2005), “Cucurbitane-Type Triterpenoids from the Fruit of Momordica charantia”, J. Nat. Prod., 68, 807-809. 5. Weng J. R. et al. (2013), “Cucurbitane triterpenoid from Momordica charantia induces apoptosis and autophagy in Breast cancer cells, in part, through peroxisome proliferator-activated receptor γ activation”, Evid.-Based Complementary Altern. Med., 2013, 1-12. 6. Zhang J. et al. (2012), “Curubitane Triterpenoids from the Leaves of Momordica charantia, and their cancer chemopreventive Effects and Cytotoxicities”, Chem. Biodivers., 9, 428-440. 7. Tan S.P. et al. (2014), “Optimized aqueous extraction of saponin from Bitter melon for production of a Saponin-Enriched Bitter melon powder”, J. Food Sci., 79, 1372-1381. 8. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 9. Wang X.J. et al. (2012), “Structures of New Triterpenoids and Cytotoxicity Activities of the Isolated Major Compounds from the Fruit of Momordica charantia L.”, J. Agric. Food Chem., 60, 3927-3933. 10. Du Z.H. et al. (2019), “Momordicoside G regulates Macrophage phenotypes to stimulate efficient repair of Lung injury and prevent urethane-induced Lung carcinoma Lesions.”, Front. Pharmacol., 10, 321-331. 11. Krawinkel M.B., Keding G.B. (2006) “Bitter gourd (Momordica charantia): A dietary approach to hyperglycemia”, Nutrition Reviews, 64, 331-337.